生物材料準(zhǔn)備
生物材料凍存前進(jìn)行的準(zhǔn)備工作可能會(huì)對(duì)凍存結(jié)果產(chǎn)生影響。對(duì)于非復(fù)制性材料，如組織，核酸和蛋白等，準(zhǔn)備過(guò)程包括確認(rèn)生物材料處于合適的溶液或凍存培養(yǎng)基中，此步驟的目的在于復(fù)蘇時(shí)達(dá)到zui大化的預(yù)期用途。然而，活細(xì)胞和微生物的穩(wěn)定性及復(fù)蘇活力受生長(zhǎng)條件和凍存前準(zhǔn)備工作的影響。
細(xì)胞凍存前需考慮多種因素，包括細(xì)胞類型、活力、生長(zhǎng)條件、生理狀態(tài)、數(shù)目以及細(xì)胞前處理等。當(dāng)建立一個(gè)新分離株或細(xì)胞系的初次種子儲(chǔ)備時(shí)，必須對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)并消毒，確保微生物污染的zui小化。每次準(zhǔn)備工作后，以及每次準(zhǔn)備新批次的培養(yǎng)物時(shí)，均要重復(fù)這個(gè)步驟。
微生物
生長(zhǎng)于通氣培養(yǎng)條件下的微生物細(xì)胞，特別是細(xì)菌和酵母，表現(xiàn)出比生長(zhǎng)于非通氣條件下的細(xì)胞更強(qiáng)的耐受冷卻和凍存?zhèn)?nbsp;的能力。T.Nei 認(rèn)為，在通氣培養(yǎng)條件下，細(xì)胞通透性更好，且開(kāi)放條件下培養(yǎng)細(xì)胞在冷卻過(guò)程中比非通氣條件下培養(yǎng)的細(xì)胞失水更快。另外，針對(duì)微生物細(xì)胞，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期及穩(wěn)定期早期獲得的細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的冰凍耐受性。從生長(zhǎng)后期和靜態(tài)培養(yǎng)早期收集的微生物細(xì)胞比生長(zhǎng)早期和生長(zhǎng)晚期的細(xì)胞表現(xiàn)了更強(qiáng)的冰凍耐受性。
一般來(lái)講，初始凍存的細(xì)胞數(shù)目越多，復(fù)蘇率越高。對(duì)于大多數(shù)細(xì)菌和酵母而言，保證約 107/ml 的細(xì)胞數(shù)才能確保足夠數(shù)量的細(xì)胞復(fù)蘇。由于這些細(xì)胞可便捷地從瓊脂培養(yǎng)板或斜面上收集，如果需要更大量的細(xì)胞，也可使細(xì)胞生長(zhǎng)于液體培養(yǎng)基中通過(guò)離心收集，在任何一種情況下，細(xì)胞通常懸浮在包含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基中。原生生物可以通過(guò)離心濃縮，但通常需要懸浮于使用的培養(yǎng)基中，之后使用等體積含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基稀釋。
針對(duì)芽孢菌凍存，需要收集芽孢并重懸于含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基中。凍存前，必須縮短操作時(shí)間且確保芽孢并未萌發(fā)。針對(duì)非芽孢菌凍存，凍存前需采用特殊程序收集菌絲體。某些具硬菌絲體的真菌，需將含有菌絲體的瓊脂塊從培養(yǎng)基中切出，并將其置于含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基中。硬菌絲體無(wú)法與瓊脂培養(yǎng)基很好粘附，生長(zhǎng)于肉湯培養(yǎng)基中時(shí)，凍存前需將菌絲體團(tuán)進(jìn)行混合。
凍存材料的活力和復(fù)蘇率由凍存前后的培養(yǎng)和生長(zhǎng)狀態(tài)決定。活力是衡量培養(yǎng)物生長(zhǎng)和繁殖的一項(xiàng)指標(biāo)。例如原生生物材料等某些材料，需經(jīng)過(guò)多次傳代才能保證其穩(wěn)定性。復(fù)蘇細(xì)胞數(shù)量的估算有多種方法，包括連續(xù)稀釋，平板計(jì)數(shù)或直接細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)對(duì)比凍存前和復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量的差異，可說(shuō)明細(xì)胞復(fù)蘇程度 或凍存過(guò)程是否成功。
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